Wirusy w służbie badań naukowych

Artykuł znajduje się w dziale Nauka, badania – nasza szansa.

Pandemia Covid-19 wywołała panikę na niespotykaną dotąd skalę na całym świecie i sparaliżowała normalne funkcjonowanie każdego z nas na kilka lat.

Oprócz intensywnych prac nad opracowaniem czułych metod diagnostycznych do wykrywania wirusa w populacji, zbadano także kwestię interakcji biologicznej pomiędzy wirusem a samą komórką.

Wielu osobom pomysł zbadania tej interakcji może wydawać się science-fiction, ponieważ do niedawna obserwowanie tych procesów w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przypominało szukanie igły w stogu siana… przy wyłączonym świetle.

Z czego właściwie składa się wirus?

Wyobraźmy sobie wirusa jako skomplikowaną łamigłówkę. Każda część stanowi ważną część, bez której cząsteczka wirusa nie może prawidłowo funkcjonować.

Funkcjonalność wirusa zależy od prawidłowego skomponowania poszczególnych składników w w pełni funkcjonalną cząsteczkę wirusa. W skrócie, wirus SARS-CoV-2 składa się z czterech białek strukturalnych (S, E, M i N), 16 białek niestrukturalnych (NSP-1 do NSP-16) i kilku białek pomocniczych.

Tylko poprzez połączenie wszystkich tych składników powstanie pełnoprawny wirus, który będzie potrafił rozpoznać odpowiedni receptor komórkowy, przekazać do komórki informację genetyczną, wykorzystać jej aparat proteosyntetyczny i skutecznie się rozmnażać.

Jeden wirus, 2 ścieżki

Aby zrozumieć, w jaki sposób wirus przedostaje się do komórki, opiszemy dwa podstawowe mechanizmy, za pomocą których SARS-CoV-2 przekazuje swoją informację genetyczną.

Aby wirus uznał komórkę za odpowiedni cel, musi najpierw rozpoznać na swojej powierzchni receptor ACE2 (enzym konwertujący angiotensynę 2). Tutaj zaczyna się ciekawy proces.

Bez zbędnych szczegółów z biochemii można to podsumować następująco: jeśli komórka nie posiada na powierzchni aktywnej transbłonowej proteazy serynowej 2 (tzw. TMPRSS2, enzymu rozkładającego białka) lub jeśli proteaza ta jest niewystarczająco aktywna , wirus przeniknie bezpośrednio do komórki w procesie znanym jako endocytoza. Endocytoza to proces, podczas którego komórka pobiera substancje ze środowiska otaczając je częścią swojej błony i wciągając do cytoplazmy (wewnętrznego środowiska komórki). Następnie po wejściu do komórki uwalniany jest wirusowy RNA, który rozpoczyna proces replikacji wirusa w przestrzeni wewnątrzkomórkowej.

W drugim przypadku wejścia komórki (w obecności TMPRSS2 na powierzchni) proces przebiega nieco inaczej. W procesie tym wykorzystywana jest zdolność do rozszczepiania wirusowego białka S poprzez proteazę TMPRSS2. W rezultacie powoduje to fuzję błony wirusa z błoną komórkową i uwolnienie wirusowego RNA do cytoplazmy komórki gospodarza.

Śledzenie wirusa w żywej komórce

Wspomniane powyżej interakcje wirus-komórka, a także wiele innych, są wyjątkowe i pomagają nam lepiej zrozumieć biologię samego wirusa. Ale czy istnieją technologie, które pozwalają nam monitorować te procesy w czasie rzeczywistym? Odpowiedź brzmi wyraźnie TAK. Jedną z możliwości jest stworzenie znakowanych fluorescencyjnie wirusów zakaźnych.

Ale czy praca z zakaźnymi patogenami jest zawsze idealna? Na to pytanie nie ma jasnej odpowiedzi. Praca z materiałami zakaźnymi wymaga specjalnych udogodnień i rygorystycznych protokołów. Standardowo wymagana jest certyfikacja laboratoriów na poziomie BSL-3, która nie jest dostępna w każdej placówce naukowej, a już na pewno nie na Słowacji.

Dlatego bardziej efektywne jest stosowanie systemów pozwalających monitorować interakcje wirus-komórka bez konieczności budowy specjalnych laboratoriów, co jest wymagające zarówno ekonomicznie, jak i technicznie. Rozwiązaniem tych problemów jest zastosowanie technologii cząstek wirusopodobnych (VLP), która umożliwia bezpieczne i wiarygodne badanie tych interakcji.

Czy to wirus czy nie wirus?

Cząstki VLP to struktury naśladujące wirusy, ale nie zawierające wirusowego materiału genetycznego. Jest to główny powód, dla którego nie mogą one replikować się jak prawdziwe wirusy, a zatem są NIEZAKAŹNE.

Co można badać za pomocą tych struktur? Oprócz rozwiązanego problemu interakcji wirus-komórka, cząstki te można zastosować także w innych obszarach medycyny, m.in. w opracowywaniu szczepionek, dostarczaniu leków bezpośrednio do komórek czy terapii genowej.

Świecący koronawirus: jak sprawić, by SARS-CoV-2 świecił pod mikroskopem

Jak już wspomniano, wirus jest złożoną łamigłówką, w której każdy element ma swoją rolę. SARS-CoV-2 składa się m.in. z czterech podstawowych białek – S, E, M i N – których obecność jest kluczowa dla składania VLP SARS-CoV-2.

Prawdziwa sztuka i kreatywność polega na dołączeniu znacznika fluorescencyjnego do tych niezbędnych białek. Ta prosta modyfikacja pozwala nam na wizualizację cząstek VLP w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Ale jak stworzyć te zmodyfikowane białka? W teorii jest to trudne, a w praktyce (niestety) jeszcze większe. W zasadzie konieczne jest wykorzystanie metod biologii molekularnej, czyli przygotowania kolistego DNA (tzw. plazmidu), niosącego informację o wymaganym białku wirusa. Ten „nośnik” informacji genetycznej zawiera, oprócz samego genu, dodatkową sekwencję markera fluorescencyjnego. Umożliwi to białku wirusa świecenie w mikroskopie fluorescencyjnym, co umożliwi nam bezpośrednią obserwację.

Wstawiamy te plazmidy, które zawierają geny wszystkich niezbędnych białek (niektóre nawet ze znacznikiem fluorescencyjnym) do odpowiednich komórek używanych do produkcji wirusa. Komórki te następnie wytwarzają pożądane, znakowane fluorescencyjnie cząstki VLP.

Zapala się, rozpoznaje właściwy receptor. OK, ale…

Podczas tworzenia VLP SARS-CoV-2, które rozpoznają właściwy receptor, dostają się do komórki poprzez endocytozę i zapalają się pod mikroskopem fluorescencyjnym, równie ważny jest wybór optymalnego modelu komórki do badania interakcji wirus-komórka.

Wiele komórek ludzkiego ciała zawiera na swojej powierzchni receptor ACE2, który jest niezbędny do przedostania się wirusa (lub w naszym przypadku VLP) do komórki. Komórki serca, nerek, jelit, a zwłaszcza płuc mają dużą ilość tego receptora. Jak jednak wybrać odpowiedni model?

Idealny model powinien być niedrogi, łatwy w utrzymaniu i nieśmiertelny. Dlatego komórki nowotworowe są odpowiednim kandydatem, ponieważ spełniają wszystkie te wymagania. Wykazano, że linie raka jelita grubego, gruczolakoraka płuc i raka wątrobowokomórkowego są optymalnymi komórkami do badania interakcji SARS-CoV-2.

Rozwiązaliśmy wybór odpowiedniego modelu. Co dalej? Nowoczesne metody manipulacji genami pozwalają na udoskonalanie tych układów modelowych. Jednym z najskuteczniejszych narzędzi wykorzystywanych dziś w tym celu przez naukę są lentiwirusy.

Jak wykorzystać wirusy na naszą korzyść

Stosując metodę inżynierii genetycznej, możemy stworzyć rekombinowane (złożone) lentiwirusy, które są najczęstszym wektorem wirusowym umożliwiającym sprawne wprowadzanie genów do komórek ssaków. Główną zaletą tego podejścia jest to, że daje nam ono możliwość włączenia obcego genu bezpośrednio do genomu komórki gospodarza, zyskując w ten sposób możliwość wykorzystania tego genu do badania interakcji wirus-komórka.

W naszym badaniu, mającym na celu analizę tej interakcji, zmodyfikowaliśmy linię raka wątrobowokomórkowego. I w taki sposób, że wstawiliśmy do niego gen odpowiedzialny za produkcję małych, znakowanych fluorescencyjnie białek, tzw. nanociał, które oznaczono czerwonym markerem.

Te nanokropki specyficznie wiążą się ze zmodyfikowanym białkiem N, które jest również znakowane fluorescencyjnie, ale tym razem w kolorze zielonym i występuje w naszych cząsteczkach VLP. Sprytnym rozwiązaniem tego połączenia jest to, że białko N zawiera, oprócz informacji o samym białku i sygnale fluorescencji, dodatkowe informacje o tzw. Etykieta ALFA. Znacznik ALFA to krótka sekwencja aminokwasów dodana do białka, która służy jako znacznik.

Ten znacznik ALFA funkcjonuje jako bardzo specyficzny element układanki, który łączy się tylko z innym konkretnym elementem – w naszym przypadku nanociałem. Efektem jest połączenie obu białek w komórce, które możemy obserwować dzięki różnym kolorom fluorescencji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Takie podejście pozwala nam szczegółowo przeanalizować czasoprzestrzenną dynamikę wnikania VLP SARS-CoV-2 do komórki.

Co nas czeka w nadchodzących latach w dziedzinie badań interakcji wirus-komórka na świecie i na Słowacji?

Do niedawna jedyną metodą wizualizacji wirusów była mikroskopia elektronowa. Jednak to podejście ma poważną wadę – wirus zostaje zabity, co uniemożliwia badanie wirusów w żywych komórkach.

Przełom w tej dziedzinie przyniosła technologia fluorescencyjna połączona z rozwojem inżynierii genetycznej, która pozwala na bezpośrednią obserwację interakcji pomiędzy wirusami a żywymi komórkami gospodarza w czasie rzeczywistym.

Z punktu widzenia osoby, która miała okazję uczestniczyć w podobnym projekcie za granicą, mogę powiedzieć, że choć na Słowacji mamy jeszcze pewne rezerwy w zakresie wsparcia technicznego dla tego typu badań, to rekompensujemy ten brak wysoko wykwalifikowani eksperci, poszukiwani na całym świecie. Utrzymanie i rozwój współpracy międzynarodowej umożliwia tym samym słowackiej nauce udział w światowych projektach badawczych.

Finansowane przez Agencję Grantów Naukowych Ministerstwa Edukacji, Nauki, Badań i Sportu Republiki Słowackiej VEGA nr. 1-0261-22.

RNDr. Marek Samec, dr hab.

• Absolwent Wydziału Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Karola w Bratysławie na kierunku Biologia Molekularna.
• Podczas swojej pracy dyplomowej skupił się na identyfikacji nowych bakteriofagów infekujących oportunistyczne patogenne szczepy bakterii.
• Adiunkt w Instytucie Biologii Medycznej Wydziału Lekarskiego Jessenius Uniwersytetu Karola w Martinie.
• Współwykonawca projektu skupionego na analizie dynamiki czasoprzestrzennej wejścia VLP SARS-CoV-2 do komórki. Współautor pracy poświęconej detekcji wirusa SARS-CoV-2 w ściekach metodami biologii molekularnej.
• Absolwentka stażu zagranicznego w Montpellier w CNRS (Centre National de la recherche scientifique), a konkretnie w instytucie IRIM (Institut de Recherche en Infectiology de Montpellier). W ramach tego stażu poznałem najnowocześniejsze procedury i technologie z zakresu wirusologii i biologii komórki, które obecnie staram się zastosować również na Słowacji.